Crispr/Cas9基因編輯
（CRISPR-Cas9 mediated gene-editing）
技術(shù)概述
CRISPR-Cas 技術(shù)是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細(xì)胞打靶和 TALEN 等技術(shù)后可用于定點(diǎn)構(gòu)建基因敲除大、小鼠動(dòng)物的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)及簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，在動(dòng)物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景將非常廣闊。
RISPR/Cas9技術(shù)極大方便了基因編輯的操作。利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯，其基本原理為：
第一步先對(duì)需要編輯的位點(diǎn)進(jìn)行切割，造成DNA斷裂；
第二步用細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制對(duì)DNA斷裂點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)。從而產(chǎn)生需要的突變結(jié)果。
目前主要有兩種方式進(jìn)行基因敲除：通過(guò)鄰端接合反應(yīng)敲除目的基因或者通過(guò)同源重組敲除目的基因。鄰端接合反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)在于只需要對(duì)DNA切割后，細(xì)胞自身就能修復(fù)。由于不需要重組載體，只需要轉(zhuǎn)入Cas9蛋白和sgRNA就能開始實(shí)驗(yàn)，啟動(dòng)非?？焖?。同源重組法需要在導(dǎo)入Cas9蛋白和sgRNA的同時(shí)，轉(zhuǎn)入同源重組的修復(fù)。
圖1、幾種基因編輯方法比較
技術(shù)詳情
優(yōu)點(diǎn)：
1、只需構(gòu)建一個(gè)載體就能開始實(shí)驗(yàn)，啟動(dòng)快速。
2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單。
缺點(diǎn)：
1、突變隨機(jī)。后期鑒定工作量大。
2、基因功能缺失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響時(shí)，很難獲得敲除成功的細(xì)胞。
原理：
工作流程：
優(yōu)點(diǎn)：
1、抗性基因穩(wěn)定整合到基因組中，陽(yáng)性率很高。
2、篩選較為容易。
缺點(diǎn)：
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較復(fù)雜。
2、需要同時(shí)構(gòu)建基因敲除載體和重組修復(fù)載體，實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)慢。
重組法基因敲除原理
重組法基因敲除流程
定點(diǎn)突變是對(duì)指定位置的一個(gè)或者數(shù)個(gè)堿基進(jìn)行精確編輯。定點(diǎn)突變的目的不是基因功能缺失，而是基因功能的改變。
與重組法基因敲除相比，定點(diǎn)突變要求編輯后基因組上不能殘留抗性基因。因此有一定可能未能正確突變的細(xì)胞在篩選中存活。定點(diǎn)突變基因編輯的難度要大于基因敲除。
在我們的pCas9gRNA7基因編輯載體中含有l(wèi)ig4和KU70抑制RNA，可以顯著抑制非重組DNA修復(fù)途徑，極大的提高定點(diǎn)突變成功率。
定點(diǎn)突變?cè)恚?/strong>
定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程：
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