技術(shù)概述
在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)是將外源cDNA片段克隆到原核表達(dá)載體上然后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，在原核生物來(lái)表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)[1]，主要包括大腸桿菌表達(dá)、枯草芽孢桿菌表達(dá)、鏈霉素表達(dá)等。原核表達(dá)載體是能攜帶插入外源基因序列進(jìn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的載體。目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)載體，一般說(shuō)的原核表達(dá)系統(tǒng)主要是指大腸桿菌表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)載體主要有PET系列、PGEX系列和PQE系列。應(yīng)用最多的是PET系列，它能在大腸桿菌中高效且高產(chǎn)的表達(dá)外源蛋白[2]。原核表達(dá)系統(tǒng)主要用途：基因功能研究、重組蛋白特性研究、重組蛋白制備/制藥。
原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：大腸桿菌遺傳背景清楚、生長(zhǎng)繁殖快、轉(zhuǎn)化效率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、能快速大量生產(chǎn)目的蛋白[3]。原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)：如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法對(duì)表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。[1]
技術(shù)詳情
載體 | 啟動(dòng)子 | 報(bào)告基因 | 抗性 | 表達(dá)宿主 | 備注 |
pET3a | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET3b | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET3c | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET5a | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET5b | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET9a | T7 | N-T7 | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET11a | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET11b | T7,Lac | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET11c | T7,Lac | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET11d | T7,Lac | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET14b | T7,AmpR, | N-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET15b | AmpR,Lac1 | N-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET17b | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET19b | AmpR,Lac1 | N-His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET20b | T7,AmpR, | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET21(+) | AmpR,Lac1 | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET21a | AmpR,Lac1 | N-T7,C-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET21b | AmpR,Lac1 | N-T7,C-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET21c | AmpR,Lac1 | N-T7,C-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET21d | T7 | N-T7,C-His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET22b | T7,AmpR,Lac1 | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET23(+) | T7 | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET26b | T7 | C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET28a | T7 | N-6×His,N-Thronbin,N-T7,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET28a-Spy | T7 | N-Spy,N–6×His,N-Thronbin,N-T7,C–6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET28a-SUMO | T7/Tac | N-6×His,N-Thrombin,,N-SUMO,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET30a | T7 | N-6×His,N-Thrombin,N-S,N-EK,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET32a | T7/Tac | N-Thrombin,C-6×His和中間6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET42a | T7/Lac | N-GST,N-S,N-His,N-Thrombin,N-HRV,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pET16b | T7,Lac | N-10×His, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | / |
pTrc-CKS | Trc | N-CKS,C-6×His，N-P3C | 氨芐青霉素 | BL21(DE3)等大腸桿菌 | / |
載體 | 啟動(dòng)子 | 報(bào)告基因 | 抗性 | 表達(dá)宿主 | 備注 |
pGEX-4T-1 | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pGEX-6P-1 | Tac/lac | N-GST，N-PP/3C | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pGEX4T-1-6×His | Tac | N-GST,C-His,N-ttrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | 可供構(gòu)建 |
pGEX-4T-2 | Tac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-4T-3 | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-5X-1 | Tac/lac | N-GST，N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-6P-2 | Tac/lac | N-GST, N-PP/3C | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-6P-3 | Tac/lac | N-GST, N-PP/3C | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-KG | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-5X-3 | Tac/lac | N-GST | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-2T | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-1λT EcoRI/BAP | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-5X-2 | Tac/lac | N-GST, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-3X | Tac/lac | N-GST,?N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-2TK | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-His | Tac/lac | N-GST, C-His | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
載體 | 啟動(dòng)子 | 報(bào)告基因 | 抗性 | 表達(dá)宿主 | 備注 |
pQE30 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | 可供構(gòu)建 |
pQE40 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | 可供構(gòu)建 |
pQE2 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE9 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE31 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-32 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-70 | T5 | C-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-80L | T5 | N-6×His,Nterm, lacIq | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-31 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-TriSystem-7 | p10 | C-8×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-TriSystem-5 | p10 | C-8×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-TriSystem His-Strep2 | p10 | HSV,C-8×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-T7-1 | T7 | N-10×His,C-6×His | 卡那霉素 | M15 | / |
pQE-T7 | T7 | N-6×His,C-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-100 DoubleTaq | T5 | N-6×His,Tag-100 | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-82L-Kan | T5 | N-6×His | 卡那霉素 | M15 | / |
pQE-82L | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pRSET-A | T7 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pRSET-B | T7 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pRSET-C | T7 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
載體 | 啟動(dòng)子 | 報(bào)告基因 | 抗性 | 表達(dá)宿主 | 備注 | ? | |
pMal-p5X | Tac | N-MBP | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c5X | Tac | N-MBP | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c4X | Tac | N-MBP, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p2X | Tac | N-MBP，N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c2X | Tac | N-MBP, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c2E | Tac | N-MBP, N-EK | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p2G | Tac | N-MBP, N-Genenase I | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p4X | Tac | N-MBP, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p5E | Tac | N-MBP | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
載體 | 啟動(dòng)子 | 報(bào)告基因 | 抗性 | 誘導(dǎo)方式 | 備注 |
pCold I | cspA | N-His, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 溫度誘導(dǎo) | 可供構(gòu)建 |
pCold-ZZ | CSPA | N-His,?N-Factor?Xa，N-ZZ | 氨芐青霉素 | 溫度誘導(dǎo) | 可供構(gòu)建 |
pCold-Sumo | CSPA | N-SUMO | 氨芐青霉素 | 溫度誘導(dǎo) | 可供構(gòu)建 |
pColdII | CSPA | N-His | 氨芐青霉素 | 溫度誘導(dǎo) | / |
pColdIII | CSPA | / | 氨芐青霉素 | 溫度誘導(dǎo) | / |
pColdTF | CSPA | N-His,?N-Trigger, N-Thrombin, N-Factor Xa，N-HRV?3C | 氨芐青霉素 | 溫度誘導(dǎo) | / |
克隆菌株用于擴(kuò)增大量質(zhì)粒，原核載體克隆菌通常是K12系列NovaBlue，JM109及DH5ɑ，這些菌是recA-endA?型，轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。
表達(dá)菌株是用于表達(dá)蛋白，原核載體表達(dá)菌是帶有染色體T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌，包括所有B型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta 及Tuner，目前BL21（DE3）用得最多的表達(dá)菌。
參考文獻(xiàn)
1. 陳曉娟等. 蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 30: 142-143.
2. 祁浩等. 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44: 4-6.
3. Mergulha?o FJM et al. Recombinant protein secretion in Escherichia coli [J]. Biotechnology Advances, 2005, 23:177-202.
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武漢-轉(zhuǎn)導(dǎo)生物
設(shè)計(jì)原核表達(dá)載體時(shí)，連不上是什么原因