mRNA/lncRNA熒光定量PCR
( realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR)
圖片來(lái)源：www.ebiotrade.com
技術(shù)特邀責(zé)編團(tuán)企
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轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室
你身邊的DNA操作技術(shù)團(tuán)隊(duì)
轉(zhuǎn)導(dǎo)生物深耕分子生物學(xué)技術(shù)十二載，是國(guó)內(nèi)極具信譽(yù)的DNA操作技術(shù)團(tuán)隊(duì)，堅(jiān)信再普通的技術(shù)做到極致也能有自己的品牌。轉(zhuǎn)導(dǎo)生物拓展RACE技術(shù)應(yīng)用，訂單量、完成率、正確率、保真性在生物技術(shù)領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位。每年10000+RACE序列擴(kuò)增訂單，為其積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，配合組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果，大幅度提升RACE方法獲取目的基因的速度與準(zhǔn)度。轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室作為國(guó)內(nèi)RACE技術(shù)領(lǐng)域的翹楚，聚生物特邀其作為RACE聚透技術(shù)板塊的責(zé)編團(tuán)企。
技術(shù)概述
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)/QRT-PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在 PCR反應(yīng)過(guò)程中，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，PCR 產(chǎn)物的積累導(dǎo)致熒光信號(hào)的增強(qiáng)。因此，利用熒光信號(hào)積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)擴(kuò)增曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR不僅實(shí)現(xiàn)真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量，而且具有靈敏度和特異性高，能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合，熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)檢測(cè)及其他各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景十分廣闊。
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物責(zé)任編輯）
技術(shù)詳情
熒光定量PCR所使用的熒光基團(tuán)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。
使用SYBR熒光染料法來(lái)進(jìn)行熒光定量PCR時(shí)，我們首先在PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量SYBR熒光染料。SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)射一定量的熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
Taqman探針則是利用探針與模板的特異性結(jié)合的特點(diǎn)，以及探針內(nèi)熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的分子特性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。這種方法可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度，嚴(yán)格針對(duì)特定堿基序列的定量實(shí)驗(yàn)。
橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）,縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集。
熒光擴(kuò)增曲線可以分為三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。?PCR?的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的?PCR?產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始?DNA?拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，?PCR?產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。
PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)次數(shù)，具有重現(xiàn)性。
可以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，區(qū)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，降低假陽(yáng)性。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，我們可以對(duì)?DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外我們還可以對(duì)PCR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析。
相對(duì)定量：采用2–⊿⊿CT法計(jì)算檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化引物條件。
絕對(duì)定量：建立標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣本中的目的基因，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到檢測(cè)目的基因的準(zhǔn)確拷貝數(shù)，模板DNA濃度越高，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小，Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。
目前實(shí)時(shí)熒光定量?PCR?技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究，臨床診斷，疾病研究以及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
1.科學(xué)研究
醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
2. 臨床疾病診斷
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。
3.動(dòng)物疾病檢測(cè)
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲(chóng)病等、炭疽芽孢桿菌。
4.食品安全
食源微生物、食品過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測(cè)。
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